2009年2月アーカイブ

文献（１）

ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.
Visel A, Blow MJ, Li Z, Zhang T, Akiyama JA, Holt A, Plajzer-Frick I, Shoukry M, Wright C, Chen F, Afzal V, Ren B, Rubin EM, Pennacchio LA.
Nature. 2009 Feb 12;457(7231):854-8.

文献（２）

Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics.
Cizhong Jiang and B. Franklin Pugh
Nature Reviews Genetics 10, 161-172 (March 2009)

Abstract | Knowing the precise locations of nucleosomes in a genome is key to understanding how genes are regulated. Recent 'next generation' ChIP-chip and ChIP-Seq technologies have accelerated our understanding of the basic principles of chromatin organization. Here we discuss what high-resolution genome-wide maps of nucleosome positions have taught us about how nucleosome positioning demarcates promoter regions and transcriptional start sites, and how the composition and structure of promoter nucleosomes facilitate or inhibit transcription. A detailed picture is starting to emerge of how diverse factors, including underlying DNA sequences and chromatin remodelling complexes, influence nucleosome positioning.

MLLの勉強会　ヒトにおけるトライソラックスの重要性。MLLは１−５まである。分子量５０万の巨大タンパクでH3K4メチレースと考えられるが不明の点も多い。今回の論文では、ＭＬＬ１欠損でH3K4me3は変化なくH3K27が変わるとしている。神経の細胞でもＬＳＢＭのデータベースでみるとMLL5が多量にでている。リダンンダンシーの問題もある。南、和田、井原先生らのTNF解析で刺激１時間後にMLL5とJMJD3のmRNAが顕著に誘導される。複合体作用が考えられる。

Nature 論文
クロマチンリモデリング因子のMLL1は出生後の神経幹細胞からの神経形成に必須である

　脳室下帯と海馬の歯状回では生涯にわたり幹細胞が存在し、神経細胞の形成が続く
　ポリコームグループタンパクPCGのBim1は出生後の神経幹細胞の自己複製に必須であることがしられるが、トライソラックスの役割は不明である。
　MLL1欠損の脳室下帯(subventricular zone;SVZ)の神経幹細胞は、生存し、グリア細胞に分化するが、神経系の細胞への分化は高度に障害されている。
　MLl1欠損細胞ではMash1（前神経細胞）とOlig2（グリア細胞）発現は保存されているが、Dlx2発現が抑制されている。
　普通の脳室下帯の幹細胞ではMash1,Oligo2, Dlx2が高度にH3K4Me3修飾されているが、MLL1欠損細胞ではDlx2がH3K3me3とH3K27Me3で標識されている。
　これらの結果は、MLL1が出生後の神経細胞分化のダイバレント領域の神経細胞分化に必須だが、グリア細胞分化にはそうでないことを示している。

実験方法　MLL1欠損マウスは血球系の異常により胎生１０−１２．５で死亡する。胎生１３．５日ではGFAPは海馬の歯状回、大脳の顆粒細胞、SVZの神経幹細胞に発現する。そこでGFAP-creとかけあわせた。うまれたあと成長遅延、失調がみられ、生後２３−２５日で死亡する。

図１　ニューロンが少ない
a.神経細胞の解剖図
b．コントロールと比べて嗅球でのニューロン数が少ない
c．神経幹細胞は存在する
d．神経細胞マーカーdoublecortin(DCX)陽性細胞のBrDU取り込みは少ない。
DCX陽性、Tuj1の神経プロジェニター細胞は存在するが、神経細胞の移動距離は４０％減少している。

図２　嗅球でのニューロン減少とグリア不変
a. アストロサイトのマーカーのGFAP陽性細胞は増えている
b. SVZの上衣層(S100陽性)は正常
c. グリアマーカーのOLIG2は正常　ミエリンベーシックプロテインも正常
d. SVZ細胞の単層培養系　Tuj1陽性の細胞への分化は１／２０
 
図３。出生後のＳＶＺにおけるDlx2の発現
このためにCre組み替えがおこるとGFPを発現するZEGレポーターをもつ神経幹細胞を培養を出生後６−７日のSVZから培養した。Creアデノをかけたあと、48-72時間後に組み替えのおこっているGFP+細胞をFACSで回収する。コントロールと組み替え細胞はBrDU取り込みは同じ率でおこるので、増殖スピードは同じである。
A,b　欠損細胞ではTuj1陽性（赤）が少ない
C--F.　エピゲノムの変化は多数の転写因子を変える可能性があるのでいろいろな遺伝子発現を調べてみた。Casp3は少なくアポトーシスは少ない。オリゴデンドロサイトマーカーのO4やアストロサイトマーカーのGFAPは多い。神経細胞発生の初期のMASH1は変わらないが、分化神経細胞のDlx2は減少している。
G.H　doublecortin(DCX、赤)と、DLX2緑の比較を正常マウスと欠損マウスで比べるとin vivoでもDLX2が顕著の低下している。
I,J,K 欠損マウス由来のSVZ細胞にpCAG-Dlx2をトランスフェクトすると、Tuj1が発現する。Tuj1欠損はDlx2欠損のためであるのがわかる。

図４　そこでDlx2プロモーターへのMLL1の結合と、H3K4,H3K27のメチル化をみた。
A. MLL1の結合はDlx2プロモーターに多い
B. Rt-PCRでみるとDlx2の発現だけがこの細胞でおちている。
C. H3K4me3は正常とMLL1欠損で変わらないが、Dlx2ではプロモーターと1kb上流サイトでH3K27が増えている。

これらの結果は、MLL1の作用はH3k4メチル化よりも、H3k27脱メチル化に作用している可能性がある。

（１）MLL1の結晶構造、（２）GSK3阻害薬でのＭＬＬ阻害、（３）堤先生らのCell掲載論文を紹介します。

（１）Structural basis for the requirement of additional factors for MLL1 SET domain activity and recognition of epigenetic marks.
Southall SM, Wong PS, Odho Z, Roe SM, Wilson JR.
Mol Cell. 2009 Jan 30;33(2):181-91.　（先週の記事参照）

 

（２）Nature 455, 1205-1209 (30 October 2008) | doi:10.1038/nature07284; Received 9 April 2008; Accepted 18 July 2008; Published online 17 September 2008

MLL白血病の維持と標的治療におけるグリコーゲンシンターゼキナーゼ3の役割

Zhong Wang1, Kevin S. Smith1, Mark Murphy1, Obdulio Piloto1, Tim C. P. Somervaille1 & Michael L. Cleary1

 Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, Stanford, California 94305, USA
Correspondence to: Michael L. Cleary1 Correspondence and requests for materials should be addressed to M.L.C. (Email: mcleary@stanford.edu).

Top of pageAbstract
グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK3）は多機能性のセリン/トレオニンキナーゼで、さまざまな生理学的過程にかかわる多くのシグナル伝達経路で働く。これらの経路のいくつかは疾患の病因に関連しているとされており、そのため、治療応用を目指したGSK3特異的な阻害剤を開発する取り組みが進められてきた。しかしながら、悪性腫瘍でGSK3を標的にすることの十分な根拠は、これまで得られていなかった。本論文では、 MLL がん原遺伝子の変異によって遺伝学的に定義される、予後不良のヒト白血病の特定な亜型の維持において、GSK3ががん化に必要であることを示す薬理学的、生理学的、および遺伝学的な研究を報告する。これまでGSK3は腫瘍形成に関連するシグナル伝達経路を抑制する役割が示されていたが、それとは対照的に今回の結果では、サイクリン依存性キナーゼ阻害分子であるp27 Kip1 の不安定化に最終的につながる機序により、逆にGSK3が MLL 白血病細胞の増殖や形質転換を支えていることがわかった。 MLL 白血病の前臨床マウスモデルでのGSK3の阻害により有望な効果が証明されたことから、GSK3はがん治療薬標的候補であると考えられる。

(3) 新規p53標的遺伝子PHLDA3の同定（Cell）

　ゲノムサイエンス分野の堤修一助教、上村直子研究員らは国立がんセンターの大木理恵子研究員らとの共同研究において、新規p53標的遺伝子としてがん抑制機能を有するPHLDA3遺伝子を同定し、2月6日付けでCell誌に報告した。
　大木博士らはこれまでにp53標的遺伝子の同定を報告しているが、今回の共同研究ではp53蛋白のゲノムへの結合およびヒストン修飾をChIP-chipおよびChIP-seq法により解析し、新たなp53標的遺伝子PHLDA3を同定した。多くのがんではがん遺伝子Aktの活性化を伴っているが、PHLDA3タンパク質はAktタンパク質の活性を抑制することから癌抑制遺伝子p53の新たな機能として注目される。

Tatsuya Kawase, Rieko Ohki, Tatsuhiro Shibata, Johji Inazawa, Tsutomu Ohta, Hitoshi Ichikawa, Naoko Kamimura, Shuichi Tsutsumi, Hiroyuki Aburatani, Fumio Tashiro and Yoichi Taya.
PH domain-only protein PHLDA3 is a p53-regulated repressor of Akt.
Cell, Vol. 136, 2009.

文献１

Role of Jhdm2a in regulating metabolic gene expression and obesity resistance.
Tateishi K, Okada Y, Kallin EM, Zhang Y.

文献２
Structural basis for the requirement of additional factors for MLL1 SET domain activity and recognition of epigenetic marks.
Southall SM, Wong PS, Odho Z, Roe SM, Wilson JR.
Mol Cell. 2009 Jan 30;33(2):181-91

ＭＬＬ１のエピゲノムマークの認識とSETドメイン活性への補足的因子の結合性の構造的基礎
Molecular cell  33, 181-191 S M Southall et al.構造生物学部門、　がん研究所　ロンドン

ＭＬＬ１（リンパ性および骨髄性の混合系譜型白血病タンパク）は、早期発生と血球形成に重要な転写因子である。ＭＬＬ１の生物学的機能は、C端側のＳＥＴドメインのＨ３Ｋ４メチレース活性が担う。ＭＬＬ１のＳＥＴドメインのAdoHcy（アドホモシステイン）とヒストンH３ペプチドとの複合体の結晶構造を解明した。   Ｈ３ペプチド+ AdoMet →　メチル化H３ペプチド＋AdoHcy
活性型を作るには、可変性の高いＳＥＴドメインのコンポーネントが再構成される必要があると考えられた。　この可能性を確認するため、ＭＬＬ複合体のＲｂＢＰ５とＡｓｈ２Ｌという２つのタンパクは活性を促進したが、Ｗｄｒは促進しなかった。さらにＨ３Ｋ４の手前と後のＨ３Ｔ３のリン酸化と、Ｈ３Ｋ９のアセチル化が活性を制御することを発見した。

イントロダクション
エピジェネティックは制御はヒストンのリジンおよびアルギニンのメチル化で転写制御がになわれる。ＭＬＬファミリーの生物学的機能はＣ端側のＳＥＴドメインのもつＨ３Ｋ４にモノ、ジ、トリメチルを付加するメチレースによりになわれる。Ｈ３Ｋ４メチル化はプロモーターの活性化をもたらす。

グローバル解析の進歩からＨ３Ｋ４メチル化は単なる活性化遺伝子のマーキングだけでなく、複雑な機能を担う。早期発生、成人では血球系、細胞周期の維持にかかわる。その多くの機能はメチレース活性が重要である。

ＭＬＬ１は、ホメオボックスの制御にかかわり早期発生を制御する。また、リンパ性および骨髄性白血病の発がん性の転座のおこる原因遺伝子である。これによりＭＬＬのアミノ端側１４００アミノ酸と、５０種類以上のパートナー遺伝子との融合タンパクが発がん性の原因となる。ＭＬＬ１の転座は、小児白血病の、治療依存的におこり、難治性である。

ＳＥＴドメインはメチレースに共通のドメインであり、第一に、AdoMetのメチル供与のＳ−Ｃ結合部分と、ε--アミンのメチル受容グループが、メチル基転移において適切な距離と位置関係をとることが大事である。第二に、活性化サイト提供する、リジンのアミノ基とＡｄｏＭｅｔのメチル基のＳＮ２の求核置換メカニズムに適した化学的環境が、重要である。

活性化にあたってＳＥＴドメインの、基質とコファクター結合面とを結びつけ、ターゲットのリジンのアルキル鎖を保持する疎水性チャンネル（または穴）が構造上の鍵である。ＭＬＬ１はモノ、ジ、トリの多段階メチル化をになうとされているが、ＳＥＴ７／９またはＰＲ−ＳＥＴ７（ＳＥＴＤ８）で保存されているモノメチル化に必須のアミノ酸が維持されている。

メチル化の特異性に加えて、標的選択の問題もある。Ｓｅｔ７／９とＭＬＬ１はＨ３Ｋ４のメチル化を触媒するが、基質となるペプチドと相互作用する共通の配列はない。むしろ多数のタンパクと複合体を作り標的を決定していると思われる。Ｗｄｒ５、ＲbＢＰ５、Ａｓｈ２Ｌ、Ｄｐｙ３０がＭＬＬ１と複合体を作る。この複合体は、進化上保存され、酵母のＳｅｔ１複合体ＣＯＭＰＡＳＳはメチル化酵素複合体研究の基礎となっている。Ｗｄｒ５、ＲbＢＰ５、Ａｓｈ２Ｌ、のいずれかがなくなるとメチレース活性はなくなる。

今回、ＭＬＬ１のAdoHcyとペプチドある場合とない場合の構造をといた。ＭＬＬ１は他のタンパクをＡｓｈ２ＬとＲｂＢＰ５は活性を著しく向上させることがわかった。

図１Ａ　ＭＬＬ１の構造と、今回用いたＳＥＴドメインの構造
Ｃ。漫画的な２方向の表示。 典型的なＳＥＴドメインはＳＥＴ−Ｉ、ＳＥＴ−Ｃ、ｐｏｓｔＳＥＴからなる穴がコファクター結合面と基質結合面の間にあることである。しかしＭＬＬ１ではＳＥＴ−ＩとｐｏｓｔＳＥＴが別々のところにある。
Ｂ　ＭＬＬ１、Ｄｉｍ５、Ｓｕｖ３９ｈ２、Ｓｅｔ７／９、とＰＲ−Ｓｅｔ７の構造類似性。
重要なアミノ酸、Tyr3942,Tyr3944,Phe3946は保存されており、４アミノ酸の主な鎖であるCys3882からPhe3885も保存されている。

図２Ａ　上記のアミノ酸の作る環境がメチル転移を助ける。
Ｂ　モノ、ジ、トリメチル活性のY3858またはY3942アミノ酸変異での影響　一番左側の野生型に比べて、モノが非常に落ちやすい。Y3858の影響が大きい。

図３　B　ＭＬＬ１にＤｉｍ−５を相互作用させるとチャンネルの４アミノ酸の移動がおこる。
Ｃ　ＭＬＬ１のＳＥＴＩ領域（緑）のＤｉｍ−５との２つの相互作用
Ｄ　複合体のモデル図
Ｅ　タンパクの補充によるメチルトランスフェラーゼ活性の変化
図４　Ａ　赤が陰性荷電、青が陽性荷電　
Ｂ　Ｈ３ペプチドの野生型と変異型ＭＬＬ１での複合体の活性変化
図５　基質結合
Ａ　基質ペプチドの結合、水素結合が灰色の点線で示してある。
Ｂ　基質ペプチドのＴ３リン酸化が抑制し、Ｋ９アセチル化が促進する。
図６　Ｃ端近傍にあるシステイン（亜鉛）ケージ
Ｂ　基質結合溝とコファクター結合ポケット

ディスカッション
複合体の必要性　ふたのあいた構造
エピゲノム環境に敏感　H３K９アセチル化との相乗作用

Aire's Partners in the Molecular Control of Immunological Tolerance
    Abramson et al., Cell 140, 123-135, 2010

要約：
Aireは胸腺ストロマ細胞に多数の末梢組織自己抗原(peripheral-tissue self antigens, PTAs)の発現を誘導し、それらの自己抗原を認識するＴ細胞のクローン除去を促進している。
Aireがターゲット遺伝子(PTA)の発現を誘導する機構はほとんど分かっていない。

Aireをターゲットとした共免疫沈降・MS解析と、RNAiを用いたノックダウンによるバリデーションを用いて、Aireと会合する多数の蛋白を同定した。
それらの蛋白は機能から４つのグループ（核への輸送、クロマチン結合・構造蛋白、転写、pre-mRNAプロセシング）に大別された。

Aireと相互作用する蛋白の中で、DNA dependent protein kinase(DNA-PK)とそれと会合する一群の蛋白は、DNA double strand brakeを修復し、また転写の伸長を促進する。
もうひとつのAire複合体はpre-mRNAスプライシングと成熟に関与している。Aireの存在下でPTAの転写産物が効率良くプロセシングされることがこれにより説明される。

今回の結果は、弱く転写されているクロマチン領域にAireが広範に作用して活性化するモデルを示唆するものである。

Fig.1  Aireと会合する候補蛋白の同定
HEK293または胸腺上皮細胞由来細胞株にFLAG tagged Aireを強制発現。
FLAG抗体によるip → MS解析でAireと会合する候補蛋白を同定。 45個の候補蛋白が同定された。
Aire会合蛋白の候補は４つのグループに大別される。
 
Fig.2  Reciprocal co-immunoprecipitationによる候補蛋白とAireの相互作用の確認

Fig,3 A～C
Aire会合蛋白候補遺伝子を shRNAでノックダウンして、Aireで発現が制御される既知の遺伝子(KRT14)の 発現への効果を検討。
Fig.3D   nuclear  transport に関与する遺伝子（下段の４つ）をノックダウンすると、Aire (GFP-tagged、強制発現）が核に局在しなくなる。


Fig.4 
Aire結合蛋白の一つであるDNA-PK(DNA dependent protein kinase)は PTA遺伝子群（Aire-dependent) の発現を制御している。
A: DNA-PKに変異のある scidマウスの胸腺上皮細胞 (MEC)では、PTA遺伝子群の発現が下がっている。
B: DNA-PK変異の有無で動く遺伝子群とAire-KOの有無で動く遺伝子群は overlapする。
C: DNA-PKはTop2a,PAPR1, H2AX, Ku80と共にAireと複合体を形成している。
E: DNA-PKをノックダウンすると、 AireとPARP-1が共沈しなくなる。

Fig.5  AireはTop2aによるDNAのDSB (double strand break)を促進する。
A: Aireとetoposide (Top2によるDSBを促進する薬剤）はどちらも、Aire-dependent genesの発現を上げる。
B: Aireで発現が上がる遺伝子とetoposideで発現が上がる遺伝子は相関している。
C: in vitroでのTop2aによるDNAの脱重合が、Aireの共存により促進される。
D: Aire陽性のマウス胸腺髄質上皮細胞(MEC)ではgH2AX (DSBのマーカー）が増加している。

Fig.6  Aireはpre-mRNAの processingを制御している
A: AireはsnRNP116/EFTUD2とnuclear specklesに共局在する。
C, D: Aire発現細胞では、Aire-dependent genesのmRNAはmature (spliced) formで存在する。
E, F: 他の転写制御因子（NF-kB, FoxP3)で制御される遺伝子の場合は、splicedとunsplicedの両方が検出される。（splicingの促進はAireに特異的）

Fig.7 Aireによる遺伝子発現制御のモデル
AireはK4-unmethylated H3に結合 → Top2aと相互作用してDNAのdouble strand breakを促進。 DNA-PKを活性化。
Chromatin remodeling complexを リクルート
Aireと会合した蛋白（DNA-PK, Top2aなど）は、PNA-pol IIの前方のH2A-H2Bを除去して,転写の伸長を促進。
Aireはpre-mRNA splicing factorsと 複合体を形成して、RNA processingを促進。

 

文献１　K３６について