2010年4月28日
GATA-dependent recruitment of MEF2 proteins to target promoters
The EMBO journal, vol. 19, p2046, 2000
Figure 1 A
ANF promoter解析
ANFには以前からMEF2結合siteは無いと報告されているが、A/T rich siteがMEF2結合配列に似ている。
Figure 1B（left pannel）
MCK promoterを用いてANF promoter site competition assay
MCKにはMEF2結合サイトがあると報告されている。
MCK promoterにANF A/T rich siteを500倍添加してもほとんどバンドはなくならない
→ANF AT rich siteにおけるMEF2結合能は低い
（right panel）
ANF AT rich siteにはMEF2Aが弱いながらも結合する
MEF2AだけでなくMEF2C,MEF2Dにも同じ結果が得られた（Data not shown）
Figure 2
A) Hela細胞、CV-1細胞、P19細胞を用いたANF promoter reporter assay
ANF promoterはMEF2により用量依存的に活性化される。
細胞種による反応性が異なる機序は不明。
B）細胞種による反応性の違いは、ANF promoterだけではなく他のpromoterでも生じる
３×MEF2：MCK(MEF2結合siteあり) promoterのMEF2結合site
α-MHC：α-myosin heavy chain（MEF2結合siteあり）
C)結合siteへの変異をいれANF promoter reporter assay
Figure 3
A)GATAとMEF2をcotransfectionさせANF promoter reporter assay
B)MEF2とGATAをcotransfectionさせANF promoter reporter assay
Figure 4
A)GATA4とMEF2Aをcotransfectionさせ結合siteへの変異をいれANF promoter reporter assay
B)GATA結合siteがなく、MEF2結合siteのみのpromoter reporter assay
MEF2結合siteのみでは相乗的な作用は認められない。
Figure 5
MEF2とGATAのinteraction解析（co I.Pならびにpull down assay）
A) HA-MEF2、Flag-GATA4を用いてcoI.P
B) MBP-GATAとMEF2A,C,Dを用いてpull down assay
C) MEF2AとGATA4のsite constractを用いてcoI.P
→GATAのC末（DNA結合配列）にMEF2Aが結合する。GATAのDNA結合配列に変異がある（G4m）とMEF2Aは結合しない
D) GATA4とMEF2 DNA結合 domain（DIVE）とのco I.P
E) GATA4 DNA結合配列とMEF2CとのcoI.P
→MEF2CのDNA結合配列に変異があってもGATA4とinteractionする
Figure 6
MEF2Aと変異を含むGATA4を用いたANF promoter reporter assay
A) MEF2Aと変異を含むGATA4を用いたANF promoter reporter assay
GATAのC末にはDNA結合配列があり、これらが欠損もしくは変異があるとpromoterは活性化されない。
B) GATA4と変異を含むMEF2を用いたANF promoter reporter assay
MEF2AはDNA結合配列が欠損しているとpromoter活性は低下する。しかし、MEF2Cについては、DNA結合配列に変異があってもpromoter活性は増強される
→GATAのDNA結合作用は重要であるがMEF2のDNA結合siteがなくてもGATAのpromoter活性化作用を増強させる
Figure 7
A)ANF以外でGATAにより制御される遺伝子のpromoter reporter assay
α-MHC：α-myosin heavy chain
α-CA：α-cardiac actin
BNP：B-type natriuretic peptide
MHCやCAでもMEF2とGATAにより相乗的にpromoterは活性化された。
しかし、β-MHCのようにすべてのGATAの標的遺伝子がMEF2による相乗的作用は得られるのではない。
B)primary cardiomyocytesにおけるANF promoter assay
ANF promoterはprimary cardiomyocytesにおいてもMEF2により活性化され、GATA結合siteに変異があるとその作用は消失した。
以上のことから、MEF2とGATAは相互作用することによりANF promoterを相乗的に活性化させた。