2009年11月 4日

nter-MAR Association Contributes to Transcriptionally Active Looping Events in Human b-globin Gene Cluster

Inter-MAR Association Contributes to Transcriptionally Active Looping Events in Human b-globin Gene Cluster

Li Wang, Li-Jun Di, Xiang Lv, Wei Zheng, Zheng Xue, Zhi-Chen Guo, De-Pei Liu*, Chi-Chuan Liang

National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) and Peking Union Medical College

(PUMC), Beijing, People's Republic of China

 

Abstract

マトリックス結合領域 (MARs) はクロマチン構成および遺伝子制御において重要な役割を有している。b-globin遺伝子クラスターにはいくつかのMARエレメントが存在しているが、これらのMARエレメントがどの様にしてb-globin遺伝子発現の制御に関与するかは不明である。この論文では、ヒトb-globin遺伝子クラスターのLCRに新規のMARエレメントを同定し、b-globin遺伝子クラスター中のMAR間相互作用えお同定している。また、いくつかの遺伝子座において高次クロマチン構造様のネットワークを形成すると考えられているSATB1が特定のMARsに結合することでb-globin特異的なMAR間相互作用に関与していることを証明する。SATB1のノックダウンによりMARsへのSATB1の結合およびMAR間相互作用頻度が顕著に減少する。結果として、ACHの確立およびa-like globinとb-like globin遺伝子発現が影響を受ける。まとめとして、SATB1は少なくとも高次クロマチン構造への影響を介してhemoglobin遺伝子、とりわけ初期分化遺伝子の制御因子であることが示唆される。

 

図1. MARHS2と相互作用するクロマチンフラグメントの同定とSATB1結合アッセイ。

A: b-globin遺伝子クラスターの模式図。縦線はHidIII消化部位。矢印は3C用プライマー。No.1: 263521, No.2: MARHS4, No.3: MARHS2, No.4: MARe, No.5: 223527, No.6: 222228, No.7: MARg, No.8: 200386。横線はChIP用プライマー。

B: QACTアッセイによるクロマチンフラグメントの捕獲頻度。MARHS2をリーダーフラグメントとして相互作用するクロマチンフラグメントを同定。

C: SATB1のChIP assay。

 

図2. 未分化およびヘミン処理K562細胞を用いた3C assay.

リーダーフラグメントをA: MARHS4, B: MARHS2, C: MARgとして実施。

D: b-like globin遺伝子発現に及ぼすヘミン処理の影響

 

図3. SATB1介在性のMAR間相互作用

A: SATB1のChIPアッセイ。B: ChIP-3Cアッセイ。

図4. SATB1のb-globin遺伝子座のクロマチン構造に及ぼす影響

A: SATB1ノックダウン後のSATB1の発現。

B: SATB1ノックダウン後の細胞におけるe-, g-, b-, a-, およびz-globin遺伝子発現。

C: e-およびg-globin遺伝子発現のreal-time PCR。

D: MAR間相互作用に及ぼすSATB1ノックダウンの影響。3C

E: SATB1のChIPアッセイ。

F: HS2とe-, g-,およびb-globinプロモーター間の3Cアッセイ。

 

図5. ヘミン処理後のSATB1の発現および修飾。

A: SATB1のRT-PCR。B: ウェスタンブロット。C: SATB1のアセチル化。

 

図6. 中期におけるb-globin遺伝子クラスターのMARsへのSATB1の結合

A: SATB1, B: H3Ac, CRNPのChIPアッセイ。As: 非同期。s: 同期(G2/M期)。