2009年11月25日

Dynamic Interactions and Cooperative Functions of PGC-1a and MED1 in TRa-Mediated Activation of the Brown-Fat-Specific UCP-1 Gene

Molecular Cell 35, 755-768, September 25, 2009
Dynamic Interactions and Cooperative Functions of PGC-1a and MED1 in TRa-Mediated Activation of the Brown-Fat-Specific UCP-1 Gene
Wei Chen, Qiheng Yang, and Robert G. Roeder.  Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, The Rockefeller University, New York, NY 10021, USA　
イントロ：PGC-1alphaもMED1もそのLXXLLドメインと、核内受容体（特にTR）の
Activation Function 2 (AF2)-containing activation domainとの相互作用によって、
プロモーター領域に動員される。しかし、TRがPGC-1alphaとMED1をどのように使い分けているか不明であった。褐色脂肪組織で誘導されるUCP-1の上流220 bpには、核内受容体が結合するEnhancer領域が知られているので、これをモデルとして、TRがPGC-1alphaとMED1に結合する様子を詳細に検討した。
図１．MEFをinsulin, PPAR gamma agonist, T3でadipocyteに分化させ、RA for 18 hrs, 8-Br-cAMP for 6 hrsで刺激してUCP-1を誘導する実験系を用いて、MED1 (C-side) はUCP-1の誘導に必要で有ることを示した。さらに、MED1 もPGC-1a も脂肪細胞の分化においてUCP-1 のEnhancerへ同時に動員されていることがChIPによって判った。
図２．UCP-1のenhancer領域をビーズに結合しておき、結合する蛋白を回収するというImmobilized template assayによって、UCP-1 promoterに二つある結合可能部位のうち、TRE/DR3 がTRa-RXRa の動員に必要であることが判った。そこで、MED1 もPGC-1a も脂肪細胞の分化においてUCP-1 のEnhancerへ同時に動員されていることを確認するため、Flag-tagged蛋白と、GST-fusion蛋白を作成した。
図３．Standard recruitment assayによって、PGC-1aは、TRa-RXRa and
T3-dependent manneでUCP-1 enhancer に動員されることを示した。さらに、PGC-1a もMED1もともにリガンド依存性にUCP-1 Enhancer へ別々に動員されていた。
MED1 全長と二つのLXXLLモチーフを含むMED1(580-701) 断片は、TRa-RXRa- and T3-dependent mannerでUCP-1 enhancer に動員される。LXXLLを含むMED1のC端を入れるとPGC-1aの結合は抑制された。実際にMED1のC端は、PGC-1aとTRa siteにおいて競合的に結合していた。しかし、LXXLLを含むMED1のC端ではなく、全長をいれると、PGC-1aの結合が逆に増加した。これはPGC-1aが他のモチーフでMED1-TRa-RXRaに結合していることを示唆していた。
図４．PGC-1aとの相互作用に必要なMED1のドメインを同定するため、GST-PGC-1a(551-797) fusion 蛋白をGSTビーズに固定し、35S-methionine-labeled MED1 断片との結合を観察した。一方、MED1との相互作用に必要な、PGC-1aのドメインも同定した。
図５．PGC-1a がそのLXLLを介したTRaのAF2との結合とは関係なくTRa- RXRa-UCP-1 enhancer complex に動員されていることを検討するため、Hisタグをつけた蛋白を精製した。MED1がないとき、PGC-1a(1-505) がT3依存性にTRa-RXRaによってUCP-1 Enhancerへ動員された。しかし、MED1のある時Full lengthのMED1があるとTR interaction domainを持たない、PGC-1a(334-797) とPGC-1a(501-797) までも動員された。これは、MED1があればPGC-1aはC端を介してMED1のC端に結合し、LXXLLは必要ないことを示す。
図６．PGC-1の動員はHel細胞から精製したMediatorの動員によって有意に促進された。LXLLを持たないPGC-1の動員もMediatorの動員によって促進された。
図７．PGC-1の相互作用のモデル。(i) an initial recruitment of PGC-1a through ligand-dependent interactions of LXXLL motifs with the AF2 domain of TRa.  (ii) subsequent recruitment of p300, with the possible participation of SRC-1 to initiate histone acetylation and other chromatin modifications that make the promoter more accessible to the general transcription machinery and the Mediator.  (iii) Interactions of the Mediator, through the LXXLL motifs in MED1, with the TRa AF2 domain and concomitant displacement of PGC-1a.  (iv) a PGC-1a transition involving displacement from TRa followed by retention on the enhancer complex through interactions of the PGC-1a RS/E domains with the C-terminal domain of MED1.  (v) a stimulatory effect of Mediator-bound PGC-1a on formation and/or function of the preinitiation complex at the promoter.
結論：核内受容体とこれら二つの蛋白の結合の様子が、クロマチンリモデリングから転写のinitiationにかけて変化する機構を解明した。

<Advanced reference on Mediator complex>
1)  Malik, S., and Roeder, R.G. (2005). Dynamic regulation of pol II transcription by
the mammalian Mediator complex. Trends Biochem. Sci. 30, 256-263.
2)  Structure of the Mediator subunit cyclin C and its implications for CDK8 function. 
J. Mol. Biol. 350, 833-842 (2005).
3)  A conserved Mediator hinge revealed in the structure of the MED7/MED21 heterodimer. 
J. Biol. Chem. 280, 18171-18178 (2005).
4) Structure and TBP binding of the Mediator head subcomplex Med8-Med18-Med20.
Nature Struct. Mol. Biol. 13, 895-901 (2006).

（和田洋一郎）