2009年5月13日
ヒストンH2AXは低酸素による血管新生に必須である．
Histone H2AX is integral to hypoxia-driven neovascularization
Matina Economopoulou, Harald F Langer, Arkady Celeste, Valeria V Orlova, Eun Young Choi1,Mingchao Ma, Athanassios Vassilopoulos, Elsa Callen, Chuxia Deng, Craig H Bassing, Manfred Boehm,Andre Nussenzweig & Triantafyllos Chavakis
タイトル：ヒストンH2AXは低酸素による血管新生に必須である．
H2AヒストンファミリーメンバーＸとそのC末端側（γ-H2AX）のリン酸化はＤＮＡ損傷時のDNA修復に関わることが知られている。低酸素はＤＮＡ損傷を誘導する生理的なストレスである一方，血管新生を引き起こすことが知られている．すなわち，低酸素により産生した血管増殖因子が内皮細胞の増殖を誘導する。
以上のように， H2AXと低酸素時の内皮機能には関わりがあることが推測される．
本論文では低酸素時の内皮細胞におけるH2AXの機能解析を行っている．
結果：
- 内皮細胞で低酸素状態はγ-H2AXを誘導した。
- H2AXの欠損により低酸素状態での内皮細胞の増殖が抑制された。
- H2AX-/-マウスにおいて発生段階での血管新生には変化がみられない．一方，増殖性網膜症，後肢の虚血，腫瘍血管新生時の低酸素が誘導する血管新生は低下した。
- 内皮細胞特異的H2afx欠損では，低酸素による網膜における血管新生，腫瘍血管新生が低下した。
結論：
H2AXは低酸素時の内皮細胞の増殖に必要であり，低酸素による血管新生に重要である。
Figure 1
(a) γ-H2AXの免疫細胞染色（緑色：γ-H2AX，青色：DAPI）．
→normoxiaでは染色が見られないが，hypoxiaでは１時間，６時間ともに見られた．
（DNA損傷を引き起こす放射線照射やhydroxyureの添加と同様の染色像が見られた）
(b) siRNAを用いたATR，ATMのノックダウンの検討（ウエスタンブロッティング）．
(c) ATR，ATMノックダウン時のγ-H2AXの発現検討（ウエスタンブロッティング）．
→ATRノックダウンによりhypoxiaによるγ-H2AXの産生が抑制された．ATMノックダウンは影響しない．
(d) siRNAを用いた-H2AXのノックダウンの検討（ウエスタンブロッティング）．
(e) H2AXのノックダウン時にnormoxia，hypoxia状態にし，FGF-2，FCSを加えた場合の内皮細胞(HUVEC)の増殖の検討．
→hypoxiaにするとFGF-2，FCS刺激による増殖が減少した．
(f)H2afxノックアウトマウスの肺における内皮細胞を用いたnormoxia，hypoxia状態での細胞増殖．
→ノックアウトマウスではhypoxia状態でのFCS刺激による内皮細胞の増殖がみられない．
(g) 未成熟網膜症（ROP）での γ-H2AXの免疫組織染色（赤色：lectin=内皮細胞，緑色：γ-H2AX，青色：DAPI）．
→未成熟網膜症（ROP）の病変部でγ-H2AXが誘導されていた．
Figure 2 野生型マウスとH2AfXノックアウトマウスの比較．
(a) ROP時の網膜における新生血管の定量．
(b) 網膜のPAS，ヘマトキシリン染色．
→ノックアウトマウスではROP時に網膜の新生血管が減少していた．
(c) 網膜全体のレクチン染色．
→ノックアウトマウスにおいて病的な血管新生は抑えられており，より生理的な血管網が観察された．
(d) 網膜のレクチン，BrdU染色．
(e) BrdUによる増殖の定量．
(f) TUNELアッセイによるアポトーシスの定量．
→ ノックアウトマウスでは増殖が抑えられ，アポトーシスが増加していた．
(g) 内皮特異的H2afxノックアウトマウスを用いた網膜の新生血管の定量．
→内皮特異的H2afxノックアウトマウスでも同様に，新生血管の減少が見られた．
Figure 3 後肢を虚血状態にした場合のH2AX欠損による影響．
(a) ドップラー流速計による血流の定量．
→ノックアウトマウスの方が虚血状態からの血流の戻りが弱い．
(b) 虚血させた筋肉におけるCD31+(内皮細胞)，BrdU+細胞の定量．
(c) 虚血させた筋肉における免疫組織染色（緑色：CD31，赤色：BrdU，青色：DAPI）
→ノックアウトマウスで内皮細胞の増殖が抑えられていた．
Figure 4 H2AX欠損による腫瘍血管新生への影響．
(a) CD31による血管の定量．
(b) CD31による免疫組織染色
→腫瘍における血管密度がノックアウトマウスで減弱していた．
(c) BrdUによる内皮細胞増殖の定量．
(d) caspase-3によるアポトーシスの定量．
→腫瘍における内皮細胞の増殖は抑えられ，アポトーシスが亢進していた．
(e) NG-2によるペリサイトの定量
→ペリサイトの数に影響していない．
(f) 腫瘍サイズの経時変化．
(g) 25日における腫瘍の重さ比較．
→ノックアウトマウスにおいて腫瘍サイズの減少が見られた．
（末弘）