2009年4月 7日

H3K9メチル化抗体の比較と作製について

Generation and characterization of　methyl-lysine histone antibodies.

Perez-Burgos L , Peters AH , Opravil S , Kauer M , Mechtler K , Jenuwein T

Methods in Enzymology. 2004;376:234-54

 

H3K9抗体は、より良いものが望まれ、また、注意深いコントロールが必要である。

理由

１．Mono, di, triのメチル化を受けるから

２．H3K9とH3K27領域は、ともに-ARKS-というアミノ酸配列にあるから。（Fig.1a）

 

抗体作成の最も重要なステップは、抗原ペプチド作成である。

１．Length (6-20AA)

２．Configuration (liner vs branched)

３．Methylation state (mono, di, or tri)

 

次のH3K9抗体について、Specificity and subnuclear localizationを検討した。

１．Upstate antibody, a linear octamer (aa 6-13)

２．Abcam antibody, a linear 12-mer (aa 23-34)

３．Homemade antibody detecting 2-branched 11-mer (aa 5-15)

４．Homemade antibody detecting 4-branched hexamer (aa 6-15)

 

特異性のアセスには、３つのコントロールがある

１．ELISAS

２．Dot blots, peptide spotting analysis

３．Protein blots with recombinant and nuclear histones

ELISASもしくはペプチドとヒストンのblotは、initial characterizationに使うものの、whole nuclear extractsをもちいたprotein blotsが、non-histone moleculeにあるepitopeとのcross reactivityの検討に必要である。

 

Peptide blot analysis

 <Fig.2>

１．Upstate antibody; high affinity with H3K9me2 but minor cross-reactivities with H3K4me2 and H3K27me3

２．Abcam antibody; high performance for H3K9me2 and minor cross react. This is surprising because used antigen was designed for an alpha-demeth H3K27 antibody.

３．2-branched antibody; good specificity.

４．4-branched antibody; multi-methyl lysine antibody.

 

 

In vivo characterization of H3K9 methylation patterns.

<Fig.3>

1.      interephsase chromatin

2.      mitotic chromosomeでは、pericentric chromatinにそまる。

3.      DAPI staining (DNA stain)で集積したところには、染まらない。

Cf. inactive X chromosomeに集積

 

Suv39h double nullを用いた結果

<Fig.4>

X chromosomeには集積

 

まとめ

<Table.1> p246

 

(稲垣）