2009年3月17日
Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs
Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs
Richard W. Carthew and Erik J. Sontheimer (Cell 136,642-655)
『役割』クロマチン構造、クロマチンの分離、RNAプロセッシング、RNA安定化および翻訳制御→主として遺伝子の発現抑制による制御。RNAiの機構と一致する。
『分類』役割、由来、複合体を形成するタンパクの種類によりsmall RNAは3つのグループに分類できる。
Short interfering RNA (siRNA)
microRNA (miRNA)
Piwi-interacting RNA (piRNA)
これらのRNAは真核生物のみに存在する。一方、small RNAと結合するAgonauteタンパクはバクテリアや古細菌に存在することが知られている。
『識別』
siRNAとmiRNA：系統発生的、生理学的条件、先駆体の二重鎖の性質により分類
piRNA ：初期は動物種で発見。生殖細胞系列で最も機能を発揮。先駆体は明らかではないが、一本鎖由来と推測される。
『結合タンパク』
siRNA/miRNA ：Ago, Argonaute
piRNA ：Piwi
siRNAs and miRNAs : Themes in common
1993年：developmental Timeを制御する内在性の因子としてlin-4がC.elegansで発見
1999年：外来性dsRNAが特定の遺伝子発現を抑制することを報告 ~21-23nt RNAi
2001年：多くの植物、動物種でsmRNAが発見された。
→miRNA：内在性遺伝子の発現制御
siRNA ：外来性ゲノムの侵入を防ぐ
一本鎖miRNA、siRNAのRNAはRNA-induced silencintg complexes(RISC) と相互作用する
初期の分類
１：miRNAは内因性遺伝子の発現制御
siRNAは外来性（ウィルス トランスポゾン等）の遺伝子制御
2：miRNAはstem-loop先駆体RNAから生成
siRNAはlong formから完全一致dsRNAが生成
（Fig1A）先駆体からDicerによってsmall RNAが形成され、Agoタンパクと結合する。
Dicer：A portal into RNA silencing
(Fig1 B)RNAaseⅢがmiRNA/siRNAを生成すると考えられており、これがDicerということがC.elegans、D.melanogasternoで示されている。特定のドメイン配列を持つ
『Dicerの数』
哺乳類 線虫 ：1
ショウジョウバエ ：2（Dicer1→miRNA、Dicer2→siRNA）
シロイヌナズナ ：4
複数のDicerを持つものは、それぞれ役割が限定
PAZドメインはdsRNAの3'overhang(~2nt)を認識.。PAZドメインとRNaseドメインの距離によりsmall RNAの長さが決まる。
Argonaute:At the Core of RNA Silencing
『分類』Argonatuteタンパクは3.つのサブグループに分類できる
Piwi ：piRNAに結合
Ago ：miRNA siRNAと結合
～ ：線虫のみ
Dicerにより切断されたdsRNAは巻き戻され、一方の鎖のみRISC複合体に組み込まれる。残りは廃棄される。
Argonauteタンパクは複数存在する。ショウジョウバエ5 ヒト8。結合するRNAに若干の違いがあるが、ヒトではその専門性が明らかになっていない。
siRNAs Sources of siRNA Precursors
基本的なRNAiは長く、直鎖状、完全一致dsRNAで直接細胞質に取り込まれる。
初めsiRNAは植物で発見され、ウィルス等のから遺伝子を防御するものとして見つかった。
(Fig2)
RISC Assembly and siRNA Strand Strand Selection
dsRNAは直接Argonauteタンパクに結合できないため、RISC assembly pathwayを利用する(fig2)
この複合体はDicer TRBP Ago2タンパクを含む。最終的にdsRNAはsiRNAに形成されRISCにロードされる。
どちらの鎖が選択されるかは5'末端のベースペアの熱力学的安定性による。二つの鎖の安定性が同じ場合は、RISCに誘導される頻度は同じになる。機構はまだ明らかになっていない。
Posttranscriptional Silencing by siRNA
RNAiの機構ではsiRNAがRISCに取り込まれ、完全一致の標的遺伝子に結合後切断が起こる。(Fig3右)この切断は、厳密であり、siRNA複合体の10-11塩基の間が切断される。一度この切断が起きると、エンドヌクレアーゼがこの分子をターゲットとして働く。
不完全一致siRNAでも転写後抑制が見られる(fig3上)翻訳抑制はエクソ切断等のmiRNAの機構に近い。実験に使用するsiRNAで完全一致でない遺伝子の抑制が見られる(off-target)。
siRNAの翻訳抑制は細胞質内で起きていると考えられている。
線虫AgoタンパクNrde-3はsiRNAの結合により核から細胞質へ移行することが知られている。
Priming the Pump:siRNA Amplification
線虫等のある生物種は、ひとつのdsRNAがあらたなsiRNAを生み出す。(RNA-dependent RNA polymerase :RdRP fig3下)RdRPをコードする遺伝子は昆虫や脊椎動物を除く真核生物で見つかっている。
1 セカンドsiRNAはファーストsiRNAのアンチセンスと一致する。熱力学的に選択されるなら両方が混在するはずなので、これまでの推論と一致しない。
2 RdRPが生成できない5'末端がジ、トリリン酸でありDicer(モノリン酸)によって生成されるものと対照的
つまりsiRNAは必ずしもdsRNAから生成されるわけではない、siRNAはRISC assembly pathwayを迂回する可能性を示している。
siRNA Can Induce Heterochromatin Formation
siRNAはヘテロクロマチンを誘導する（Fig3左下）
RISCはクロモドメインを有するSwi６を誘導し、ヒストンメチル化酵素(HMTs)のH3K9のメチル化にも寄与している。（hig3左上）
これによりsiRNAの効果を強め遺伝子抑制につながっている。
MicroRNA Biogenesis
多くのmiRNAは2つ以上の転写産物ユニットから生成される。
転写物はmiRNAクラスターをエンコードしているか、miRNAとタンパクの両方を含んでいる。後者の場合はmiRNAはイントロン部位に位置している。
プロセッシングはmiRNA内でのステムループ構造に依存している（fig4）
miRNAとsiRNAの違いは末端の正確さである。MicroRNAは多少の違いがあるが、多くの遺伝子の末端のように明確なENDをもつ。一方siRNAの末端は統一されていはいない。
多くのmiRNAの発現は遺伝子に制御されている
Yan－｜ miR-7－｜ Yan（翻訳）ハエ
let-7－｜ Lin28－｜ let-7 C.elegans
MicroRNA Associatein
miRNAの鎖の選択性は熱力学的なもので、5'末端の安定性が弱いものが選ばれるが、必ずしも完全ではない。実際両方の鎖がAgoタンパクと複合体を形成し検出されている。一般的に、相互作用する鎖をmiRNA、残りの鎖をmiRNA＊と呼んでいる。Fig４
Posttranscriptional Repression by miRNAs
例外を除いて、動物種のmiRNAの結合サイトはmRNAの3'UTRに複数存在する。ほとんどの領域で、ミスマッチやバルジ構造をとる。一方植物は完全一致配列で遺伝子のCDS領域に結合する。
シロイヌナズナでミスマッチのmiRNAが見つかっていることから、完全一致のmiRNAは後から獲得された機能で、翻訳阻害がデフォルトであると考えられている。
どのように翻訳阻害が起きているのか？３つのモデルが提唱されている
1 miRISCとeLF4EがｍRNA5'キャップ構造への結合を阻害するモデル（fig5 左上）
2 miRISCがmRNA tail1の脱アデニル化を促進させるモデル（fig5 下）
3 miRISCが60sリボソームユニットの結合を阻害するモデル(fig5 左下)
Bind Men and the Elephant?
細胞の状態によりmiRNAの役割が異なる。
let-7：増殖中細胞の翻訳は阻害するが、G1アレストでは翻訳活性化因子となる。
細胞のステージに依存し、増殖中かアレストなのかには依存しない。
またリンパ球でのTNFαはマクロファージの熟成に必須であるが、グロースアレストの状態になるとmiR-369-3pはTNFα抑制から活性へと変化する。
またmiRNAが3'UTRか5'UTRに結合するかで、抑制なのか活性なのかが変化する。
（野中）