2008年9月18日

要旨3

【紹介論文】
The HRX Proto-oncogene Product Is Widely Expressed in Human Tissues and Localized to Nuclear Structures　
Blood, Vol 89, No 9, 1997: pp 3361 - 3370

【内容】
HRX-ENL融合蛋白質に対する抗体を作製し、ヒト組織、細胞株を用い分子の局在を観察した．
結果、多くの細胞で核内に点在することが確認された．
また、この結果は11q23のトランスロケーションには依存しなかった．

【解説】
I. ターゲット分子
　　Fig 1. HRX + EML の融合蛋白質 （約220KDa）

II. 抗原
　　A. 合成ペプチド for HRX（モノクロ）
　　　　　1．840 - 854 aa
　　　　　2．2370 - 2384 aa　
　　　　　3．2830 - 2845 aa
　　B. GST fusion protein 大腸菌発現物（ポリクロ）　
　　　　　GST-HRX
　　　　　　　　　1．160 - 356 aa (197aa)
　　　　　　　　　2．428 - 498 aa (71aa)
　　　　　GST-ENL
　　　　　　　　　1856 - 1908 aa (53aa)

III. モノクロのスクリーニング
　　　　合成ペプチド抗原固相ELISA

IV. ポリクロの精製
　　　　GST fusion 抗原アフィニティー精製

V. 抗体機能解析
　　　Fig 2.
　　　Mammalian 細胞（Bosc 293 cell）による HRX+ENL 融合蛋白質発現 WBによる抗体の特異性を確認
　　　Fig 2A. Lane1, 5の比較から190KDのバンドはN端が切れている
　　　Fig 2B. 抗体により認識できる分子が違う、aHRX2 は190kDのバンドを認識できない
　　　Fig 2C. HRXキメラタンパクの発現確認： 11q23 translocation のある HB11;19, RS4;11細胞では220 kD, 240 kDの位置にバンドを確認。しかし11q23 translocation のないMolt-4細胞ではバンドを確認できなかった。

　　　Fig 3.
　　　ヒト組織を用いた免疫染色
　　　Fig 3a, b : Thyroid、Fig 3c, d: CNS、Fig 3e, f, g: cardiac myocyte
　　　Fig 3h, i : glomerulus of kidney、Fig 3j, k, l : liver
　　　Fig 3m, n : macrophage in the lung、Fig 3o, p, q : tonsil cell
　　　正常細胞におけるWild-type HRXの発現は幅広く発現していたが、細胞種により発現のレベルは異なった．(Table 2.)

　　　Fig 4.
　　　HRXは転写因子TAL-1, PMLと違う場所に存在している

　　　Fig 5.
　　　U937細胞とRS4; 11細胞を用いMoAb HRX107 とPoly-aHRX2とで染色像を比較
　　　両抗体ともHRXは点状核内分布を示した．
　　　細胞種によりドットの大きさなどに差は見られたが、11q23 translocation の有無には無関係であった．(Table 1.)

　　　Fig 6.
　　　Flagタグ付き強制発現系においてMoAb HRX 107とflag抗体との染色像は重なる

まとめ
今回はMLLファミリーの抗体を作製する際、過去の抗体作製方法を調査が目的であり、抗体作製方法の観点から情報をまとめる
と以下のようになる。
•　MLLファミリーの抗体を作製する場合、抗原はペプチド免疫、 大腸菌 部分長発現精製物が有効
•　特異性確認は動物細胞による全長強制発現物の使用、セルラインの使用が有効

(杉山)