2008年7月16日

PR-SET7の欠損モデルを使った機能解析をショウジョウバエとほ乳類で行った論文３報

論文１、２　PR-SET7のノックアウトの表現系　ショウジョウバエでの検討
論文３　白血病細胞でのRUNX1の発現サイレンシング

論文１　Aberrant monomethylation of histone H4 lysine 20 activates the DNA damage checkpoint in Drosophila melanogaster
Ayako Sakaguchi and Ruth Steward
JCB 176, 2007, 155-162

概要　ショウジョウバエでPR-SET7のノックアウトを解析すると、ＤＮＡ損傷のチェックポイントが活性化されている。サイクリンＢが減少し、有糸分裂への進展が阻害される。染色体の凝集も低下する。PR-SET7は染色体の凝集に必須なのであろう。

図１　三齢の幼虫の脳を解析した。野生型は二重のリングと活発な細胞分裂を示す。これがPR-SET7変異体ホモでもヘテロでも大きく乱れている。H4モノメチルが低下している。 H4モノメチルの免疫染色は凝集した染色体（リン酸化H３セリン１０で示される）にみられる。

図２　
(a) 濃縮されていないところではH4K20モノメチルが検出できていないだけかもしれないので、有糸分裂にはいる細胞をていねいに観測した。野生型では２％、 PR-SET7変異では1.3％であった。Prophaseの細胞がPR-SET7変異で増えている。コルヒチン処理への反応性は悪くないので紡錘糸の形 成は異常ないと思われる。
(b) この変異は、DNA損傷のチェックを担うATR変異のmei41D3変異株では正常化する。
(c) 野生型ではH３のリン酸化は染色体凝集とともに現れるが、PR-SET7変異体では最初から染色体全体に現れる。染色体凝集と紡錘糸形成がカップルしていないと思われる。

図３　サイクリンＢが低下する。これを分解するユビキチンリガーゼ複合体APC/Cの構成タンパクのcdc27が変異であれば回復するので分解の亢進と思われる。

図４　異常な染色体パターン（II-IV）が増し、（d）でみるDNA量が2n以下(矢印)が検出される。 遅延染色分体の頻度はPR-SET7にmei41変異（ATR変異）を加えると最も悪い。

図５　DAN損傷チェックポイントの活性化　S期と有糸分裂インデックスが減少し、細胞周期がストップしていることが推測される。これはチェックポイントを壊したMei変異体では回復かむしろ逆の増加するのでチェックポイントによる制御と思われる。

図６　ダブルストランドブレイク(DSB)を検出するH2Avのリン酸化（PH2Av）はγ線照射によりPR-SET7変異でも増加するので正常に反応している。PR-SET7変異でもγ線照射後のPH3陽性の分裂細胞減少はきちんとおこる。

以上よりPR-SET7の変異は凝集以上で染色体異常を感知するATRの系を介して細胞周期のG２／Mチェックポイント停止をおこさせているのであろう。グローバルな状態の規定にPR-SET7は従来想定されていたより重要と思われる。

論文２。Suv４-20は生存に必須ではない
Functional characterization of the Drosophila Hmt4-29/Suv4-20 Histone Methyltransferase Ayako Sakaguchi and Ruth Steward
Genetics 179, 2008, 317-322

概要　H4K20のメチル化はヒトでは２個の遺伝子　suv4-20h1とsuv4-20h-2でになわれるが、ショウジョウバエでは１個 のsuv4-20が行う。この変異体ではジメチルおよびトリメチルが減少し、モノメチルが増加するが生育異常はみられず、クロマチン上にサイレントな領域 を作るPEVも正常である。

図１　２種の決失変異　１０９はsuv4-20欠失、となりのskpAも欠失のためトランスジーンでレスキューしている。コントロールの１７４はsuv4-20は正常、skpA欠失は同様にレスキューしている。
図２、図３　メチル化の変異　
表１　突然変異源への感受性は１０９と１７４で変わらない。
表２　γ線への感受性も亢進していない。
表３　stubble　PEVへの影響も変わりない。
すなわち、suv4-20は染色体の安定性、サイレンシングには関与していないと思われる。 これからみるとモノメチル化のPR-SET7が重要に思われる。　

論文３。PR-SET7による白血病細胞における遺伝子発現抑制 　　　L3MBTL1を動員してRUNX1の転写活性化を抑制する
PR-SET7 establishes a repressive trans-tail histone code that regulates differentiation
Jennifer K Sims and Judd C Rice ;　　 Mol Cell Biol　　Epub May12 2008

概要
　筆者らはPR-SET7によるH4K20のモノメチル化とH3K9のモノメチル化のテイル間の相互作用するコードが重要である。PR-SET7 の触媒作用をなくした変異酵素を用いてもこの抑制的相互作用がおこるところから、タンパク質相互作用をになうことが大事と考えられる。 　H4K20モノメチルは、L3MBTL1抑制タンパク（ポリコーム）を動員し、RUNX1の発現を抑制する。白血病細胞K562で、PR-SET7を ノックダウンするとRUNX1が活性化される。巨核球の分化の上で重要な役割を果たしていると思われる。

イントロ
　ヒストン修飾酵素は、細胞種特異的な転写因子の発現を制御することにより、細胞分化を制御する。代表例はH3K27のトリメチル化を制御する ショウジョウバエESC-E(Z)複合体である。H3K27トリメチルはポリコーム複合体PRC1のクロモドメインに結合し、HOX遺伝子クラスターを制 御する。
　H4K20は転写抑制されているクロマチン部位に多くPR-SET7はH4K20のモノメチル化、Suv4-20は、ジおよびトリメチル化を になう。H4K20モノメチルは、L3MBTL1の３つのMBTリピートに結合する。L3MBTL1は、クロマチンを抑制型とし、E2Fの標的遺伝子を抑 制する。特にRUNX1の抑制は白血病発症に関係する。この経路の役割を検討する。

図１　PR-SET7によるH3K9のモノメチル化
Hela細胞でのsiRNAの効果　ラミン、G9a, PR-SET7と、触媒部位を変異させたcatalytically dead PR-SET7(R265G変異体)の過剰発現
G9asiRNA H3K9モノおよびジメチルが減る
PR-SET7siRNA H4K20モノメチルが減ると同時にH3K9モノメチルが減る
変異体過剰発現 H4K20 モノメチルが減る

A) RUNX1の発現量は、PR-SET7のshRNA、触媒作用のないPR-SET7過剰発現、L3MBTL1のshRNAで増加する。
B) RUNX1タンパク量の増加
C) RUNX1 プロモーターと160kb上流のH4K20モノメチルのない領域のChipアッセイ　PR-SET7のノックダウンはH4K20およびH3K9のモノメチ ルの消失、L3MBTL1結合低下　PR-SET7触媒欠損はL3MBTL1結合と、H3K9モノメチルは維持できるがH4K20メチル化ができない。
D) C）の判定量的図示

図３　HELA細胞でのPR-SET7とL3MBTL1コトランスフェクションでのH4K20メチル化への効果。L3MBTL1だけだと H4K20モノメチル中心だが、PR-SET7が過剰発現でジおよびトリメチルが増える。RUNX1プロモーターのL3MBTL1とH4K20モノメチル

図４　H4K20メチル化の低下が巨核球への分化をうながす。K562細胞でのRUNX1プロモーター　ヘミンやTPA処理でPR-SET7は減少する。H4K20モノメチルはTPA処理で特に低下する。同時にH3K9も低下する。

図５　K562のTPAでの分化
(A) H4K20モノメチルとH3K9モノメチルの低下と、L3MBTL1結合が低下する。
(B) 半定量化
(C) CD41陽性の細胞はH4K20モノメチルが少ない。
(D) 反定量化。

図６　PR-SET7 酵素活性変異の過剰発現による巨核球への分化

補足　プリント参照
HistoneH4K20 monomethylation promotes transcriptiona; repression by L3MBTL1
Kalakonda et al. Oncogene 2008 1-12

図３　L3MBTL1の結合ペプチド
L3MBTL1のH4K20とH3K9のモノメチルへの結合は、histoneテイルのacidic な環境を好む。３つのMBTドメインの２番目のD355Nはこの２つへの結合がなくなる。

図４　PR-SET7とL3MBTL1の相互作用
(a) ２９３細胞一過性過剰発現したHA-L3MBTL1とmycPR-SET7の共沈　核抽出液
(b) K562細胞にHA-L3MBTL1を強制発現し、stableをとり、antiHAでの免疫沈降でPR-SET7との相互作用を検出した。なおPRMT1,G9aとは相互作用しない。ESET,EZH1,EZH2とも相互作用しない。
(c) 大腸菌で作成したHis-tagged-PR-SET7とin vitro translationでS35標識されたL3MBTL1の各ドメインとの相互作用。なおホモ２量体を作る性質を使ってレーン８ではダイマーをコントロールとしてみている。

図５　レポーター系　stable発現系で抑制レポーターをセットしているが十分なシグナルは難しいように見える。
HEK2930TK22 株を用いる。 GAL4結合サイトを５個もった下にTKプロモーターとルシフェレースをおいてある。ここに、GAL4のDNA binding domainのみか、DNA binding domainとPR-SET7融合タンパク、触媒ドメインに変異をいれたD356N変異を含む融合タンパクをいれたものでレポーター活性をみている。 PR-SET7だけでは２０％低下、L3MBTを共発現すると４５％低下する。しかし５０％以上の活性が残っている。酵素活性欠損タンパクでは活性が １００％残っている。

図６　L3MBTL1のクロマチンへの結合
筆者らはL3MBTL1のE2F結合を報告してきた。そこで今回は、サイクリンEプロモーターのE2F結合サイトへのL3MBTL1結合をみた。 細胞にG9a, PR-SET7, L3MBTL1をトランスフェクとして、siRNAの効果をみている。L3MBTL1のノックダウンは５０％までは細胞が生存できるがそれ以上になると致 死的である。５０％のノックダウンでは1.5倍のサイクリンＥ上昇にとどまる。

この論文筆者らの先行研究
A trans-tail histone code defined by monomethylated H4K20 and H3K9 demarcates distinct region of silent chromatine
Jennifer K Sims, -----Judd C Rice JBC 2006, 281, 12760
概要
抗体を作成して検討したところ、H4K20モノメチルは、ダイメチル、トリメチルと異なるクロマチン領域を染色する。特にH4K20モノメチルとH3K9モノメチルはサイレントクロマチンを特異的に反映している。

図１　H4K20メチル化モノ、ジ、トリ特異抗体の作成　１６?２５番目のアミノ酸を抗原にポリクロナル抗体を作成した。
図２　
(a) メスのMEFでモノとジ抗体は特異的な染色体領域を染色した。主に核周辺部でPol IIと一致しないサイレントな領域に多い。トリメチルはちょっと違った染色パターンを示す。
(b) モノとジ抗体での染色はマージしない。
図３
(a) H4K20モノメチルとH3K9モノメチルは一致する。
(b) H4K20モノとH3K9ジメチルは一致しない。H4K20ジとH3K9ジメチルは一致する。
(c) H4K20トリメチルとH3K9トリメチルは一致する。
図４
(a) HeLa細胞の伸ばしたクロマチンファイバーでみるとH4K20モノとH3K9モノが一致する。
(b) (c) はジメチル、トリメチル
(c) H4K20ジメチルはH3K9モノメチルの隣に位置する。
図５　
(a) HeLa細胞から調整した、モノヌクレオソームをH4K20モノ抗体で免沈するとジおよびトリメチルはあまり落ちてこない。
(b) H4K20トリメチル抗体で免沈すると、モノもジもよく落ちてくる。

これと矛盾する論文は
H4K20 monomethylation is increased in promoter and coding regions of active genes and correlates with hyperacetylation
Heribert Talasz, Wilfried Hellinger JBC 2005 280 38814
Activation of b-major globin gene transcription is associated with recruitment of NF-E2 to the b-globin LCR and gene promoter
Tomoyuki Sawada, Kazuhiko Igarashi and Mark Groudine PNAS 2001 98 10226